Deprecated: mysql_connect(): The mysql extension is deprecated and will be removed in the future: use mysqli or PDO instead in /home1/zensea/public_html/thuvienykhoa.vn/connect.php on line 11
Đăng ký | Sitemap
 
Nghiên cứu một số điều kiện tối ưu trong biểu hiện proinsulin người tái tổ hợp ở hệ e.coli - bl21(de3) với vector pet - 28a(+)
 

Nghiên cứu một số điều kiện tối ưu trong biểu hiện proinsulin người tái tổ hợp ở hệ e.coli - bl21(de3) với vector pet - 28a(+)

Trên thế giới, hàng năm có thêm hàng triệu người mắc bệnh đái tháo đường (ĐTĐ). Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh cũng gia tăng hàng năm theo sự phát triển của đời sống kinh tế, sự gia tăng dân số, tuổi thọ và sự thay đổi lối sống. Đáng lưu ý là nước ta chưa sản xuất được insulin nên phải nhập ngoại toàn bộ, giá thành rất cao; đòi hỏi phải đặt ra những vấn đề nghiên cứu để có thể tiếp cận với công nghệ và nghiên cứu sản xuất insulin trong tương lai.
Insulin là một hormon, bản chất là protein, do các tế bào  của tiểu đảo Langerhans tuyến tụy tiết ra, có vai trò quan trọng trong chuyển hoá đường glucose máu người và động vật. Tiền chất của insulin là proinsulin, với đoạn peptid C liên kết chuỗi peptid A và chuỗi peptid B. Dựa theo con đường tự nhiên, người ta đã sản xuất insulin thông qua sản xuất proinsulin tái tổ hợp, sau đó dùng enzym đặc hiệu cắt đoạn peptid C, tạo insulin có  hoạt tính. Như vậy, nghiên cứu tạo được proinsulin sẽ là tiền đề cho nghiên cứu sản xuất insulin tái tổ hợp.
Với mong muốn góp phần nghiên cứu sản xuất insulin tái tổ hợp dùng làm thuốc điều trị ĐTĐ, dựa trên việc thiết kế thành công vector biểu hiện pET - 28a(+) có chứa gen mã hoá proinsulin người tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu:
Biểu hiện gen mã hoá proinsulin người và tìm hiểu một số điều kiện tối ưu trong biểu hiện protein này.
Sản phẩm của biểu hiện này được kiểm chứng bằng phương pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamid (SDS - PAGE) và xác nhận lại bằng phương pháp Western blot.
I.    VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Vật liệu
Chủng E.Coli được chọn dùng cho nuôi cấy biểu hiện là BL21(DE3) của hãng Novagen. Vector pET - 28a(+), 5369 bp, có điểm khởi đầu phiên mã của pBR322, với gen kháng kanamycin, chứa promotor T7 được cảm ứng bằng IPTG (Isopropyl
- D - 1 - thiogalactopyranoside); đã được cài gen tổng hợp proinsulin (pET - 28a - PINS).
2.    Phương pháp
    Phương pháp biểu hiện proinsulin ở hệ E.Coli - pET - 28 - a(+)
    Nuôi cấy tế bào biểu hiện
Sau khi biến nạp vector vào tế bào E.Coli , tế bào biểu hiện được nuôi cấy trong canh thang LB (Luaria - Bertani broth), kanamycin 50 ìg/ml, ở 370C, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Khi OD600 đạt tới 0,5 - 1,0 thì bổ sung IPTG và tiếp tục nuôi cấy trong điều kiện thích hợp.
    Phân tích protein bằng điện  di  biến tính trên gel polyacrylamid (SDS - PAGE)
Proinsulin có trọng lượng phân tử khá nhỏ (khoảng 12 kDa), do đó phải dùng gel polyacrylamid 15% có sự hiện diện của SDS (Sodium dodecyl sulfate) cùng với thang chuẩn protein và mẫu chứng là dịch phá tế bào không cảm ứng bằng IPTG.
    Xác định protein bằng  phương  pháp Western blotting
SDS - PAGE chạy song song 2 bản gel, 1 bản dùng chuyển màng thực hiện Western blot, còn 1 bản nhuộm với coomasie blue R250 để làm đối chứng. Dựa vào sự có mặt của His - Tag trong vector pET - 28a(+) , dùng kháng thể chuột kháng His - Tag của hãng Roche (Đức), làm kháng thể 1 cho phương pháp Western blot, kháng thể 2 là kháng thể thỏ kháng IgG chuột gắn alkaline phos- phatase.

Nghiên cứu này dựa trên việc thiết kế thành công vector biểu hiện pET - 28a(+) có chứa gen mã hoá proinsulin tái tổ hợp. Mục tiêu: biểu hiện gen mã hoá proinsulin người và tìm hiểu một số điều kiện tối ưu trong biểu hiện proinsulin. Phương pháp nghiên cứu: tìm điều kiện tối ưu về mật độ tế bào ban đầu, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ IPTG, thời gian biểu hiện trong biểu hiện proinsulin. Sản phẩm của biểu hiện này được kiểm chứng bằng điện di biến tính trên gel polyacrylamid (SDS - PAGE) và xác nhận lại bằng Western blot với kháng thể kháng His - Tag. Kết quả: đã chứng minh được sự biểu hiện gen proinsulin bằng phương pháp SDS - PAGE và Western blot; Tìm được bốn điều kiện tối ưu trong biểu hiện proinsulin. Kết luận: điều kiện tối ưu trong biểu hiện proinsulin: mật độ tế bào ban đầu OD600  0,6 - 1,0; nhiệt độ nuôi cấy 300C; nồng độ IPTG là 0,4 mM; thời gian nuôi cấy 20 giờ

Trên đây là tóm tắt của tài liệu:" Nghiên cứu một số điều kiện tối ưu trong biểu hiện proinsulin người tái tổ hợp ở hệ e.coli - bl21(de3) với vector pet - 28a(+) ". Trong toàn văn không có lỗi chính tả. Để đọc toàn văn xin nhấn Download

MÃ TÀI LIỆU
    DTCCS00634
Loại tài liệu
    (.pdf)
Mức phí: :
    10.000 điểm Tài khoản của bạn có: điểm
Nhấn để tải
   
 
PHẦN MỀM HỖ TRỢ DOWNLOAD IDM LÀ NGUYÊN NHÂN HỆ THỐNG TRỪ SAI ĐIỂM ( TẮT NÓ TRƯỚC KHI TẢI TÀI LIỆU )
ĐỂ ĐẢM BẢO QUYỀN LỢI CỦA CÁC BẠN:
KHI CÓ LỖI LIÊN QUAN ĐẾN NẠPTRỪ ĐIỂM, TÀI LIỆU CHỈ CÓ MỘT PHẦN XIN VUI LÒNG LIÊN HÊ BỘ PHẬN HỖ TRỢ.
HOTRO@THUVIENYKHOA.VN ( 24/24H ) - 0932.716.617 ( 8AM - 8PM )
BẠN CÓ THỂ TÌM KIẾM NỘI DUNG BỔ SUNG Ở ĐÂY
 
       
Tài khoản
Mật khẩu
Lưu mật khẩu
Đăng ký | Quên mật khẩu
Ebook hay
SIÊU ÂM CHẨN ĐOÁN VÀ MỘT SỐ VẤN ĐỀ LÂM SÀNG SẢN PHỤ KHOA LIÊN QUAN TẬP 1
CHẨN ĐOÁN ĐIỀU TRỊ Y HỌC HIỆN TẠI TẬP I
Sổ tay lâm sàng - chẩn đoán và điều trị
Điện tâm đồ - từ điện sinh lý đến chẩn đoán lâm sàng
Xem thêm
 
QUẢNG CÁO